DEFINISI DAN MACAM KROMATOGRAFI

KROMATOGRAFI

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.

Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisis dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisis lebih lanjut. Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS),Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS).

Macam - Macam Kromatografi

Kromatografi ada bermacam-macam diantaranya kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, penukar ion, penyaringan gel dan elektroforesi. 

1. Kromatografi Kertas 

kromatografi kertas merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat digunakan. kromatografi kolom bertujuan untuk purifikasi dan isolasi komponen dari suatu campurannya. Teknik ini sangat sederhana. Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut.
Cara melakukannya, ciplikan yang mengandung campuran yang akan dipisahkan diteteskan/diletakkan pada daerah yang diberi tanda di atas sepotong kertas saring dimana ia akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda telah kering, kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sesuai dengan satu ujung, dimana tetesan cuplikan ditempatkan, tercelup dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai noda tercelup karena berarti senyawa yang akan dipisahkan akan terlarut dari kertas).
Pelarut bergerak melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagai pita atau noda yang terpisah. Jika senyawa tidak berwarna harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia. Yaitu dengan menggunakan suatu pereaksi-pereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua dari senyawa-senyawa. Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf.

2. Kromatografi lapis tipis

 

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu tehnik pemisahan yang sederhana dan banyak digunakan. Metode ini menggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi penyerap untuk lapisan tipis dan kering bentuk silika gel, alomina, selulosa dan polianida. Untuk menotolkan larutan cuplikan pada lempeng kaca, pada dasarnya dgunakan mikro pipet/ pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari lempeng dicelup dalam larutan pengulsi di dalam wadah yang tertutup. (Chamber)

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ini mirip dengan kromatograafi kertas, hanya bedanya kertas digantikan dengan lembaran kaca tau plastik yang dilapisi dengan lapisan tipis adsorben seperti alumina, silike gel, selulosa atau materi lainnya.

Lapisan tipis adsorben pada proses pemisahan berlaku sebagai fasa diam. Kromatografi lapis tipis lebih bersifat reproduksibel ( bersifat boleh diulang) dari pada kromatografi kertas.

Sebagai fasa diam dalam KLT berupa serbuk halus dengan ukuran 5 – 50 mikrometer. Serbuk halus ini dapat berupa adsorben penukar ion. Bahan adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan gel, alumina, dan serbuk selulosa. Partikel  silica gel mengandung gugus hidrosil dipermukaannya yang akan membentuk ikatan hydrogen dengan molekul – molekul pokar.

Untuk membuat lapisan tipis pada KLT perlu dibuat bubur (slurry) ber air dari serbuk halus tadi. Zat pengikat dapat menggunakan gips, barium sulfat, polivenil alcohol atau kanji perlu ditambahkan, untuk membantu peletakan lapisan tipis pada penyangga. Bubuk halus ini kemudian ditebarkan pada papan penyangga (kaca, plastik atau aluminium), secara merata sehingga diperoleh ketebalan lapisan 0,1 – 0,3 mm. lapisan tipis adsorben diaktifkan dengan pengeringan didalam oven pada suhu 100 ^oC selama beberapa jam.

(http://robbaniryo.com/ilmu-kimia/kromatografi-lapis-tipis-klt/)

            Pemisahan campuran dengan cara kromatografi didasarkan pada perbedaan kecepatan merambat antara partikel-partikel zat yang bercampur pada medium tertentu. Dalam kehidupan sehari-hari pemisahan secara kromatografi dapat kita temui pada rembesan air pada dinding yang menghasilkan garis-garis dengan jarak ternentu.

3. Kromatografi penukar ion

Kromatografi pertukaran ion adalah salah satu teknik pemurnian senyawa spesifik di dalam larutan campuran. Prinsip utama dalam metode ini didasarkan pada interaksi muatan positif dan negatif antara molekul spesifik dengan matriks yang barada di dalam kolom kromatografi.Metode ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ilmuwan bernama Thompson pada tahun1850. Secara umum, teradapat dua jenis kromatografi pertukaran ion, yaitu:

• Kromatografi pertukaran kation, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan positif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan negatif.Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang mengandung gugus karboksil (-CH2-CH2-CH2SO3- dan -O-CH2COO-). Larutan penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah asam sitrat, asam laktat, asam asetat, asam malonat, buffer MES dan fosfat.
• kromatografi pertukaran anion, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan negatif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan positif. Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang mengandung gugus -N+(CH3)3, -N+(C2H5)2H, dan –N+(CH3)3. Larutan penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah N-metil piperazin, bis-Tris, Tris, dan etanolamin.

Metode ini banyak digunakan dalam memisahkan molekul protein (terutama enzim).Molekul lain yang umumnya dapat dimurnikan dengan menggunakan kromatografi pertukaran ion ini antara lain senyawa alkohol, alkaloid, asam amino, dan nikotin.

        Fase Diam

Ada banyak macam penukar ion, tetapi penukar ion polisterina berikatan silang paling luas penggunaannya.Gambar 65. b menggambarkan struktur resina penukar anion dengan matriks poliestirena berikatan silang yang sama, tetapi dengan gugus tetraalkilamonium. Resina poliestirena kerng cenderng mengembang jika dimasukkan dalam pelarut. Air menetrasi ke dalam resina dan hidrasi, membentuk larutan sangat pekat dalam resina. Tekanan osmosa cenderung menekan air lebih banyak ke dalam resina dan padatan itu mengembang, jadi volumenya bertambah. Jumlah air yang diambil resina tergantung pada ion penukar dari resina dan menurun dengan bertambahnya jumlah ikatan silang. Resina penukaran ion juga mengembang dalam pelarut organik, tetapi pengembangannya lebih kecil daripada dalam air.

Fase Gerak

Kebanyakan pemisahan kromatografi penukar ion dilakukan dalam media air sebab sifat ionisasi dari air. Dalam beberapa hal, digunakan pelarut campuran seperti air, alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak media air, reteni puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik dan oleh pH fasa gerak. Kenaikkan kadar garam dalam fasa gerak menurunkan retensi senyawa cuplikan. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion cuplikan bersaing dengan ion fasa gerak untuk gugus penukar ion pada resina.

4. Kromatografi elektroforesis

Kromatografi elektroforesis menyangkut perbedaan migrasi spesies-spesies bermuatan dalam suatu larutan di bawah pengaruh dari penggunaan suatu gradient potensial. Kecepatan migrasi setiap spesies tergantung atas ukuran, bentuk dan muatan spesiesnya. Metoda elektroforesis merupakan metoda pemisahan suatu  zat berdasarkan perbedaan muatan dan massa melekul relative dari komponen-komponennya.  Pemisahan terjadi karena perbedaan laju migrasi komponen-komponen bermuatan oleh pengaruh medan listrik.

5. Kroamatografi Gas

Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair).

Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini.

Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.

Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini.

Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif.

PEMISAHAN ZAT WARNA SECARA 

KROMATORAFI

A. Tujuan
Memisahkan zat-zat warna yang terdapat pada suatu tumbuhan.

B. Landasan Teori
Fotosintesis adalah suatu proses biokimia yang dilakukan tumbuhan, alga, dan beberapa jenis bakteri untuk memproduksi energi terpakai (nutrisi) dengan memanfaatkan energi cahaya. Hampir semua makhluk hidup bergantung dari energi yang dihasilkan dalam fotosintesis. Akibatnya fotosintesis menjadi sangat penting bagi kehidupan di bumi. Fotosintesis juga berjasa menghasilkan sebagian besar oksigen yang terdapat di atmosfer bumi. Organisme yang menghasilkan energi melalui fotosintesis (photos berarti cahaya) disebut sebagai fototrof. Fotosintesis merupakan salah satu cara asimilasi karbon karena dalam fotosintesis karbon bebas dari CO2 diikat (difiksasi) menjadi gula sebagai molekul penyimpan energi. Cara lain yang ditempuh organisme untuk mengasimilasi karbon adalah melalui kemosintesis, yang dilakukan oleh sejumlah bakteri belerang.
Tumbuhan menangkap cahaya menggunakan pigmen yang disebut klorofil. Klorofil merupakan katalisator fotosintesis yang sangat penting dalam semua jaringan tumbuhan berfotosintesis. Klorofil terdapat dalam kloroplas dan sering berkaitan dengan protein, tetapi mudah diekstraksi ke dalam pelarut lipid. Di dalam tumbuhan, paling sedikit terdapat lima jenis klorofil. Secara kimia, seluruh jenis klorofil mengandung satu inti porfirin dengan satu atom Mg terikat di tengah. Perbedaan setiap jenis klorofil disebabkan perbedaan dalam rantai alifatik yang terikat pada inti porfirin.
Klorofil bersifat labil, selama isolasi dapat mengurai atau kehilangan atom Mg. Klorofil yang kekurangan rantai samping pirol akan membentuk klorofilida, sedangkan klorofil yang kehilangan atom Mg akan membentuk protoklorofil.
Selain klorofil, di dalam tumbuhan juga terdapat pigmen warna lain yang disebut karotenoid. Selain sebagai pigmen warna, karotenoid juga membantu dalam fotosintesis. Terdapat lebih dari 300 jenis karotenoid, tetapi yang terdapat dalam tumbuhan tinggi hanya sedikit, umumnya berupa karoten. Salah satu turunan karotenoid, yaitu hidrokarbon tak jenuh turunan likopen atau turunan likopen teroksigenesi dikenal sebagai xantofil. Xantofil yang umum terdapat berupa monohidroksikaroten (ketrin dan rubixantin), dihdroksi-karoten (zeakantin) atau dihidroksi-epoksikaroten (violaxantin).
Untuk memisahkan zat-zat warna yang terdapat pada suatu tumbuhan dapat dilakukan dengan berbagai cara, tetapi teknik kromatografi merupakan teknik yang banyak digunakan. Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael Tswett, seorang ahli botani Rusia, pada tahun 1906.
Kromatografi berasal dari bahasa Yunani ‘Kromatos’ yang berarti warna dan ‘Graphos’ yang berarti menulis. Kromatografi merupakan metode pemisahan yang sederhana. Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusunan cuplikan antara dua fasa, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam absorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion dinamakan kromatografi sehingga masing-masing zat dapat diidentifikasi atau ditetapkan dengan metode analitik (Anonim, 1995).
Pada dasarnya, teknik kromatografi ini membutuhkan zat terlarut terdistribusi di antara dua fase, satu diantaranya diam (fase diam), yang lainnya bergerak (fase gerak). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat terlarut lainnya yang tereluasi lebih awal atau lebih akhir. Umumnya zat terlarut dibawa melewati media pemisah oleh cairan atau gas yang disebut eluen. Fase diam dapat bertindak sebagai zat penyerap atau dapat betindak melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi antara fase diam dan fase gerak (Anonim, 1995).
Prosedur kromatografi masih dapat digunakan, jika metode klasik tidak dapat dilakukan karena jumlah cuplikan rendah, kompleksitas campuran yang hendak dipisahkan atau sifat berkerabat zat yang dipisah.
Kromatografi ada bermacam-macam diantaranya kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, penukar ion, penyaringan gel dan elektroforesis.
Macam-macam kromatografi
a. Kromatografi Lapis Tipis
Yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi.
b. Kromatografi Penukar Ion
Merupakan bidang khusus kromatografi cairan-cairan. Seperti namanya, system ini khusus digunakan untuk spesies ion. Penemuan resin sintetik dengan sifat penukar ion sebelum perang Dunia II telah dapat mengatasi pemisahan rumit dari logam tanah jarang dan asam amino.
c. Kromatografi Penyaringan Gel
Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan membentuk susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya. Molekul dengan berat antara 100 sampai beberapa juta dapat dipekatkan dan dipisahkan. Kromatografi permeasi gel merupakan teknik serupa yang menggunakan polistirena yang berguna untuk pemisahan polimer.
d. Elektroforesis
Merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa gerak. Senyawa bermuatan positif akan menuju ke katode dan anion menuju ke anoda. Sedangkan kecepatan gerak tergantung pada besarnya muatan.
e. Kromatografi Kertas
Merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat digunakan. Teknik ini sangat sederhana.
Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut.
Cara melakukannya, ciplikan yang mengandung campuran yang akan dipisahkan diteteskan/diletakkan pada daerah yang diberi tanda di atas sepotong kertas saring dimana ia akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda telah kering, kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sesuai dengan satu ujung, dimana tetesan cuplikan ditempatkan, tercelup dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai noda tercelup karena berarti senyawa yang akan dipisahkan akan terlarut dari kertas).
Pelarut bergerak melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagai pita atau noda yang terpisah. Jika senyawa tidak berwarna harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia. Yaitu dengan menggunakan suatu pereaksi-pereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua dari senyawa-senyawa. Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf.









Hasil Kromatografi Kertas
Nilai Rf
Beberapa senyawa dalam campuran bergerak sejauh dengan jarak yang ditempuh pelarut; beberapa lainnya tetap lebih dekat pada garis dasar. Jarak tempuh relative pada pelarut adalah konstan untuk senyawa tertentu sepanjang anda menjaga segala sesuatunya tetap sama, misalnya jenis kertas dan komposisi pelarut yang tepat.
Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:
Rf = jarak yang ditempuh oleh senyawa
jarak yang ditempuh oleh pelarut

Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal. Rf = Jarak titik tengah noda dari titik awal. Jarak tepi muka pelarut dari titik awal.
Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu:
1. Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan-perubahan harga Rf.
2. Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.
3. Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan kompisisi mempengaruhi harga Rf.
4. Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan partisi.
5. Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf mereka.

C. Alat dan bahan
1. Alat
- Satu buah tabung kultur - Cawan Gerus
- Prop gabus tabung kultur - Mortar
- Kawat penggantung kertas kromatografi - Dua buah tabung reaksi
- Rak tabung kultur - Counteiner silinder
- Kertas Kromatografi - Sendok Tanduk
- Gunting - Gelas Ukur
- Mistar - Pipet Mikro
- Pensil - Pipet
2. Bahan
- Daun tanaman Manihot esculentum
- Aseton
- Petroleum ether
D. Cara kerja
1. Petiklah daun Manihot esculenta yang tua , kemudian sobek-sobek kecil tanpa ada ibu tulang daun.

2. Timbanglah daun tersebut sebanyak 5 gram

3. Masukan sobek-sobekan kecil daun Manihot esculenta kedalam cawan gerus , tambahkan sedikit aseton , kemudian geruslah dengan mortir hingga halus.

4. Masukan daun halus tersebut ke dalam tabung reaksi , tambahkan kembali sedikit aseton, aduklah dengan baik dan tutuplah rapat-rapat .

5. Kemudian tabung reaksi dimasukan kedalam centrifugal selama ± 15 menit ( untuk mendapatkan ekstrak

6. Teteskan ekstrak daun tersebut ( larutan jernih yang berada dibagian atas ) dengan menggunakan pipet mikrometer pada kertas kromatografi yang telah diberi tanda titik hingga berwarna hijau pekat

7. Masukan kertas kromatografi yang telah ditetesi ekstrak daun tersebut kedalam counter silinder dengan posisi ujung kertas sedikit menyentuh pelarut.

8. Amati perubahan warna yang terjadi pada kertas kromatografi.

E. Hasil Pengamatan
Kelompok Rate of Low
Klorofil a Klorofil b Xantofil Karoten
I 0,906 0,821 0,497 -
II 0,952 0,504 0,957 0,966
III 0,925 0,831 0,473 0,954
IV 0,604 0,458 0,916 0,929
V 0,963 0,752 0,467 0,981
VI 0,942 0,761 0,491 0,955

Gambar Hasil Kromatografi

F. Pembahasan
Pada praktikum kali ini akan dibahas mengenai pemisahan zat-zat warna pada daun tumbuhan Manihot esculentum (menggunakan daun yang sangat tua karena banyak mengandung klorofil) secara kromatografi. Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya menjadi komponen-komponennya. Adapun kromatografi yang digunakan adalah kromatografi kertas karena menggunakan kertas saring Whatman No.39. Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari campuran bersama-sama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula. Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap sedangkan fase gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Untuk melarutkan klorofil digunakan petroleum ether karena klorofil tidak larut dalam air. Setelah ekstrak didapatkan, estrak diteteskan pada kertas kromatografi dengan menggunakan pipet mikrometer setetes demi setetes hingga berwarna hijau pekat. Namun sebelum itu, ujung kertas dibuat bentuk segitiga dan pada bagian tengahnya diberi tanda titik kecil sebagai bagian dalam penetesan ekstrak. Kertas dimasukkan ke dalam counteiner silinder (tabung kromatografi) dan tabung ditutup agar tidak ada udara yang masuk. Alasan untuk menutup tabung adalah untuk meyakinkan bahwa udara dalam tabung terjenuhkan dengan uap pelarut. Penjenuhan udara dalam tabung dengan uap menghentikan penguapan pelarut sama halnya dengan pergerakan pelarut pada kertas.
Setelah beberapa menit didapatkan hasil sebagai berikut.

Grafik Rate of Law pada Hasil Kromatografi dari Kelompok 6
Berdasarkan gambar hasil kromatografi di atas dapat dibuat grafik rate of law, sehingga kita dapat membandingkan pigmen mana yang menempuh jarak paling jauh. Dari grafik di atas dapat kita lihat bahwa urutan pigmen pada kertas dari yang terkecil ke yang terbesar adalah kuning (Xantofil), hijau muda (Klorofil b), hijau tua (Klorofil a), dan jingga (Karoten). Artinya Karoten meenempuh jarak yang paling jauh dari titik awal dan yang menempuh jarak yang paling dekat adalah Xantofil. Seperti yang kita ketahui bahwa rumus kimia dari pigmen tersebut antara lain Xantofil {C40H54(OH)2}, Klorofil a {C55H72O5N4Mg} , Klorofil b {C55H70O6N4Mg}, dan Karoten {C40H56}. Jadi, dapat kita simpulkan bahwa berat molekul Karoten lebih kecil disusul oleh Xantofil, Klorofil a, dan berat molekul terbesar adalah Klorofil b (dapat dilihat dari banyaknya atom C dan atom O), sehingga urutan pigmen yang menempuh jarak terjauh adalah Karoten, Xantofil, Klorofil a, dan Klorofil b. Namun, hasil pengamatan kami tidak sesuai dengan teori tersebut. Adapun ketidakcocokan hasil pengamatan dengan teori dapat disebabkan oleh human eror baik pada waktu pengamatan yang kurang lama ataupun pigmen sebenarnya belum terhenti benar sehingga hasil pengamatan tidak sesuai dengan fakta yang ada. Untuk lebih lanjut, berikut akan kami sajikan grafik rate of law pada hasil kromatografi dari beberapa kelompok.
Grafik Rate of Law pada Hasil Kromatografi dari Beberapa Kelompok


Grafik di atas menjelaskan rate of law yang terjadi pada setiap pigmen. Maksudnya bahwa bagaimana pigmen tersebut melampaui jarak dari titik awal dibandingkan dengan jarak ditempuh pelarut. Seperti yang dapat kita lihat pada grafik di atas adalah kelompok II dan IV memberikan hasil yang sama di mana rate of law yang paling kecil adalah Klorofil b disusul oleh Klorofil a, Xantofil, dan Karoten. Artinya bahwa Klorofil b menempuh jarak yang paling dekat dari titik awal sedangkan Karoten menempuh jarak yang paling jauh Hal ini disebabkan karena Klorofil b memiliki berat molekul yang paling besar dan Karoten memiliki berat molekul yang palig kecil. (Keterangan : hasil pengamatan kedua kelompok ini sesuai dengan fakta).
Namun, terdapat beberapa kelompok, yaitu kelompok I, III, V, dan VI memberikan hasil yang kurang tepat atau tidak sesuai dengan teori. Pada kelompok I, pigmen Karoten tidak terlihat karena pada saat itu, waktu pengamatan dihentikan sehingga pigmen Karoten belum mulai muncul. Adapun rate of row pada keempat kelompok ini memberikan hasil yang sama pula, yaitu pigmen Xantofil menempuh jarak yang paling dekat disusul oleh pimen Klorifil b, Klorofil a, dan Karoten. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh kesalahan pada saat praktikum baik berupa human eror maupun faktor dari luar.
H. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan, zat-zat warna yang didapatkan dalam tumbuhan daun Manihot esculentum adalah Klorofil a (hijau tua), Klorofil b (hijau muda), Xantofil (kuning), dan Karoten (jingga).

Jawaban Pertanyaan
1. Fungsi dari setiap pigmen adalah sebagai berikut.
a. Klorofil a berperan secara langsung dalam reaksi terang fotosintesis, yang mengubah energi matahari menjadi energi kimiawi.
b. Klorofil b merupakan pigmen lain dalam membrane tilakoid yang dapat menterap cahaya dan mentransfer energinya ke klorofil a, yang kemudian mengawali reaksi terang.
c. Karoten adalah pigmen fotosintesis berwarna oranye yang penting untuk fotosintesis. Zat ini membentuk warna oranye dalam wortel dan banyak buah dan sayur lainnya. Dia berperan dalam fotosintesis dengan menyalurkan energi cahaya yang dia serap ke klorofil dan memperluas spectrum dari warna-warna yang dapat menggerakkan fotosintesis.
d. Xantofil adalalah suatu pigmen yang membantu dalam penerimaan sinar.
2. Fungsi aseton dan ether adalah sebagai pelarut klorofil.
3. Rumus bangun

Sedangkan untuk Karoten {C40H56} dan Xantofil{C40H54(OH)2},
4. Berdasarkan hasil pengamatan kami, pigmen yang terletak paling atas adalah Karoten dan pigmen yang terletak paling bawah adalah Xantofil. Artinya bahwa Karoten menempuh jarak yang paling jauh dari titik awal dibandingkan dengan pigmen lain karena memiliki berat molekul yang paling kecil.